Волоконные нейроинтерфейсы в задачах нейрофизиологии
Работа нашей группы в этом направлении связана с применением оптических методов для исследований в области нейрофизиологии и когнитивных технологий. Исследования проводятся совместно с возглавляемой академиком РАМН, профессором Константином Владимировичем Анохиным, лабораторией нейробиологии памяти НИИ нормальной физиологии имени П.К.Анохина РАМН. Часть сотрудников и аспирантов нашей лаборатории вовлечена в проект по исследованию физических основ сознания, который реализуется в НБИК центре НИЦ «Курчатовский институт» и объединяет широкий спектр специалистов в области биологии, нейрофизиологии, физики, математики и информационных технологий. В рамках этого проекта наши сотрудники имеют возможность работать на уникальной многофункциональной мультифотонной системе OLYMPUS FV1000MPE с двумя прямыми микроскопами OLYMPUS BX61WI и фемтосекундным лазером оптической накачки. В нашей лаборатории исследование функциональных активности нейронных тканей и клеток связано прежде всего с развитием нелинейно-оптических методик и применением новых волоконно-оптических технологий визуализации этой активности.
Центральной проблемой нейрофизиологии является вопрос, как элементарные процессы в нейронах порождают когнитивные функции и сложные формы памяти у животных и человека. Наша нервная система обрабатывает огромное количество информации, закодированной в спайках, которые распространяются между нейронами. Нерешенной до сих пор задачей является исследование молекулярных, клеточных и системных основ высших функций мозга. Если бы была возможность записывать сигналы от всех активных нейронов в сети при заданном поведении, то можно было бы воссоздать биологические механизмы памяти и интеллекта. К сожалению, для существующих техник измерения активности нейронов это невозможно по нескольким причинам.
Как правило, более точные методы регистрации ионных токов (с помощью электродов) сильно ограничены по числу одновременно регистрируемых нейронов. С другой стороны при одновременной регистрации активности большого числа нейронов теряется информация об обработке данных отдельным нейроном в сети, вся информация просто усредняется. Именно оптические методы регистрации нейронной активности потенциально могут преодолеть эти проблемы. Оптические методы регистрации обладают высоким пространственным и временным разрешением, и с помощью активно развивающихся в последнее время методик изготовления трансгенненных маркеров и потенциал-чувствительных красителей могут обеспечить одновременное получение функциональной и морфологической картины отдельных нейронов в большой группе.
С другой стороны, быстро развивающиеся волоконно-оптические технологии открывают новые горизонты в биофотонике, обеспечивая платформу для создания новых волоконно-оптических систем визуализации, ориентированных на разнообразные приложения биофотоники. Флуоресцентная микроэндоскопия с использованием световодов является наименее повреждающим методом исследований, обеспечивающим клеточное разрешение в глубоких слоях мозга, но использование стандартных волоконно-оптических систем сопряжено с целым рядом трудностей. Например, из-за волоконной дисперсии происходит уширение сверхкоротких лазерных импульсов, необходимых для эффективного многофотонного возбуждения биомолекул. Также высокая вероятность повреждения биологических тканей накладывает строгие ограничения на лазерную интенсивность при работе in vivo, что может быть решено за счет повышения эффективности сбора нелинейного люминесцентного отклика биомолекул. Однако небольшие величины числовых апертур стандартных волоконных зондов не позволяют эффективно собирать люминесцентный отклик, испускаемый в полный телесный угол. Одним из путей реализации новых и оптимизации существующих биофотонных волоконных компонент в нашей работе является использование фотонно-кристаллических световодов. Фотонно-кристаллические (микроструктурированные) волокна являются новым типом оптических световодов с архитектурой поперечного сечения, представляющей микроструктуру с промодулированным показателем преломления оболочки, что принципиально позволяет варьировать в широком диапазоне дисперсионные свойства волноводных мод, степень локализации электромагнитного излучения, эффективную площадь моды и числовую апертуру волокна.
Другой путь заключается в использовании многосердцевинных оптических волокон (т.н. пучков волокон). Такие оптоволокна состоят из нескольких тысяч сердцевин, спаянных вместе и идущих параллельно, с сохранением взаимного расположения. Свет, введенный в отдельную сердцевину, распространяется по ней к другому концу. Отдельная сердцевина выступает, таким образом, в роли пикселя передаваемого изображения. Все сердцевины в совокупности позволяют передать изображение с одного торца на другой. Такие оптические волокна обладают гибкостью сравнимой с обычными волноводами с одной сердцевиной и могут быть использованы для передачи изображения из мозга свободноподвижного животного. При этом один конец волокна погружается в мозг животного, а другой конец может сопрягаться с различными оптическими установками, например, широкопольным или конфокальным флуоресцентным микроскопом.
Данная методика обладает низкой инвазивностью благодаря малому диаметру оптического волокна. На рисунке 3А приведено изображение многосердцевинного оптоволокна, использованного для передачи изображения на рисунке 3Г. Оптоволокно имеет диаметр 300 мкм и скошено под углом 45° с помощью шлифовки. Острый угол улучшает процесс погружения волокна в ткани мозга. При этом ход лучей в результате преломления на границе мозг-стекло меняется мало, по сравнению со случаем прямого торца, из-за близости показателей преломления мозга (n ≈ 1,34) и стекла (n ≈ 1,45). В нейрокогнитивных исследованиях особое значение имеют долговременные эксперименты, в которых прослеживается изменение активности мозга животного на протяжении нескольких дней и недель. Для того чтобы проводить такие эксперименты, используются размыкаемые волоконные интерфейсы. Для соединения двух оптоволокон применяются специальные керамические ферулы. Ферулы изготовлены с высокой точностью и позволяют производить соединения с сохранением соосности. На рисунке 3В приведена фотография мыши с вживленным многосердцевинным волокном. Оптоволокно вклеено в керамическую ферулу, закрепленную на черепе. Сердцевины в оптоволокне локально образуют шестиугольную решетку, однако на больших расстояниях порядок нарушается (Рисунок 3Б) из-за различия в размерах сердцевин. Это сделано специально для уменьшения эффектов межмодового взаимодействия между сердцевинами, приводящего к размытию изображения. При соединении двух многосердцевинных волокон, отдельные сердцевины накладываются друг на друга случайным образом, что может приводить к вариациям пропускания света. Однако, благодаря высокому фактору заполнения, среднее пропускание системы двух соединенных оптоволокон оказывается достаточным для передачи изображения в размыкаемом формате.
Рисунок 3. (А) Микрофотография многосердцевинного оптоволокна диаметром 300 мкм, зашлифованного под углом 45° для лучшей проходимости в тканях. (Б) Бинаризованное изображения торца многосердцевинного волокна. Как видно сердцевины уложены нерегулярно и имеют разные размеры и форму, среднее расстояние между сердцевинами – 3,5 мкм. (В) Трансгенная мышь с вживленным многосердцевинным волокном. (Г) Флуоресцентное изображение, полученное из мозга трансгенной мыши линии Thy1-EGFP через многосерцдевинное волокно в режиме конфокальной микроскопии. К изображению применено гауссово размытие, для устранения пиксельности вызванной отдельными сердцевинами.
Пока свет распространяется внутри сердцевины, перетекания в другие сердцевины практически не происходит. Однако после выхода в свободное пространство, излучение расходится в стороны в пределах конуса, определяемого числовой апертурой оптоволокна, что приводит к быстрому размытию изображений удаленных объектов. Фактически, при микроскопии через многосердцевинное волокно, фокальная плоскость совпадает с торцом волокна. Это негативно сказывается на изображении клеток, поскольку они редко подходят вплотную к торцу и могут при этом деформироваться. Для решения этой проблемы, на торец волокна прикрепляется градиентная линза, которая перестраивает изображение с некоторого рабочего расстояния (обычно 20-80 мкм) перед торцом, на торец многосердцевинного волокна (Рисунок 4А). В качестве градиентной линзы используются кусочки многомодового градиентного волокна, которые привариваются к многосердцевинному. Предварительное травление оптоволокон в растворе плавиковой кислоты позволяет выровнять диаметры свариваемых волокон, а также получить ультратонкие изображающие зонды диаметром 70 мкм (Рисунок 4Б). Ультратонкие зонды обладают ещё меньшей инвазивностью. Если уложить вместе несколько таких зондов различной длины, то, можно не изменяя условий эксперимента адресоваться к нейронам, расположенным на различных глубинах в мозге животного (Рисунок 4Г). Это представляет интерес для нейрокогнитивных исследований, поскольку нейроны, расположенные в различных частях мозга и даже в различных слоях коры, обладают различными функциями. Одновременное измерение активности нейронов различных слоев может расширить понимание процессов обработки информации в мозге. Схема эксперимента приведена на Рисунке 4В. Экспериментальная установка представляет собой конфокальный микроскоп, в фокусе которого помещен торец многосердцевинного волокна. Другой конец волокна подсоединен к волокну, вживленному в мозг мыши. В данной схеме имеется возможность регистрации сигнала как с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) для получения изображения конфокальной микроскопии, так и с помощью высокочувствительной камеры (ПЗС). Наблюдение с помощью камеры обеспечивает большее отношение сигнал/шум, однако проигрывает в контрасте, поскольку дает изображение широкопольной микроскопии, в которой расположенные вне фокуса слои дают большой вклад в измеряемый сигнал.
Рисунок 4. (А) Ход лучей в многосердцевинном зонде с градиентным объективом. Заведенное в сердцевину излучение перефокусируется градиентной линзой в точку на рабочем расстоянии х от торца зонда. (Б) Различные многосердцевинные зонды с градиентыми объективами. Снизу-вверх: сваренные оптоволокна исходных диаметров 160 мкм (многосердцевинное) и 125 мкм (градиентное), стравленное в растворе плавиковой кислоты до 125 мкм многосердцевинное и градиентное, оба волокна стравлены до 70 мкм для получения ультратонкого зонда. (В) Схема лазерного сканирующего конфокального микроскопа, сопряженного с многосердцевинным оптоволокном. В схему добавлена камера (ПЗС) для возможности переключения между режимами конфокальной и широкопольной микроскопии. В фокусе объектива размещается длинное многосерцдевинное оптоволокно, другой конец которого подсоединятся к вживленной в мозг мыши ответной части. (Г) Схема адресации составного зонда к двум популяциям нейронов, расположенных на различных глубинах в мозге мыши.