Использование современных физических инструментов в области биологии и медицины является одним из доминирующих трендов развития науки и сопутствующих технологий. Оптические методы в настоящее время широко используется для исследования структуры сложных химических и биологических соединений, в частности, белков. Спектроскопия поглощения и комбинационного рассеяния, Фурье- спектроскопия, а также целый спектр нелинейно-оптических методов обеспечивают высокую информативность, пространственное и временное разрешение. Одним из новых методов, помогающих получить ответы на вопросы о динамике и конформационных изменениях в сложных молекулярных соединениях и ангармонизме колебаний является двумерная импульсная инфракрасная спектроскопия.  Этот метод по сути является одним из нелинейно-оптических методов, реализуемых за счет резонансного четырехволнового взаимодействия предельно коротких лазерных импульсов среднего инфракрасного диапазона с молекулярными переходами исследуемых объектов. Эта методика является информативной, но в тоже время очень сложной, требующей наличия уникальной лазерной и измерительной техники, работающей в среднем инфракрасном спектре. Это условие является принципиально важным, так как в этом диапазоне располагается значительная часть практически значимых колебательных и вращательных резонансов биологическим молекул. Техника двумерной ИК-спектросокпии активно развивается в различных зарубежных университетах и научных центрах, однако, в России практически не используется, в том числе в связи с необходимостью использования сложной и дорогостоящей экспериментальной техники. Наша научная группа обладает необходимым базовым экспериментальным оборудованием и богатым опытом реализации нелинейно-оптических методов, и стремится развивать и использовать метод двумерной инфракрасной ИК спектроскопии для структурной  диагностики сложных органических соединений. В первую очередь объектом исследований могут быть белковые структуры, составляющие основу опто- и термочувствительные каналов, а также новые типы маркерных и флуоресцентных белков, используемых в нейрофотонике, опто- и термогенетике.

Двумерная  ИК спектроскопия является относительно новым и эффективным методом нелинейно-оптической спектроскопии, обеспечивающим получение большего объема спектральной информации относительно стандартных методик инфракрасной спектроскопии. Это преимущество реализуется за счет варьирования и регистрации по нескольким спектрально-временным переменным и в результате дает информацию о связи колебательных мод, ангармонизме колебаний, динамике конформационных изменений в сложных молекулах с фемтосекундным временным разрешением.  Можно сказать, что методы двумерной и многомерной ИК-спектроскопия являются развитием методов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопии). Однако, в ЯМР-спектроскопии временное разрешение составляет величины порядка миллисекунд и более, поэтому даже твердотельную ЯМР-спектроскопию трудно применить к динамическим системам. Совмещение высокого временного разрешения и спектральной чувствительности к структурным характеристикам делают двумерную инфракрасную спектроскопию чрезвычайно мощным экспериментальным инструментом.

Можно сказать, что любое спектроскопическое измерение, которое изображается как функция двух переменных, в некотором смысле является двумерным спектром, однако, в настоящее время термин «двумерная спектроскопия» применяется к ситуации, реализуемой именно в следующей интерпретации.  На исследуемый образец падают три импульса A, B и C и генерируют сигнал S. Импульсы разнесены во времени с задержками t₁  и t₂, а сигнал излучается во времени t₃. Первый импульс с волновым вектором k_A  переводит систему в когерентную суперпозицию между основным состоянием |0> и возбужденным состоянием |1>. Второй импульс k_B преобразует суперпозицию в совокупность возбужденных состояний. Населенность в возбужденном состоянии не колеблется, но сохраняет фазу состояния суперпозиции. Третий импульс k_C преобразует населенность обратно в состояние когерентной суперпозиции, которое излучает поле сигнала с волновым вектором k_S = — k_A + k_B + k_C. Двумерный спектр затем генерируется путем сканирования времени t₁  и записи сигнала как функции времени t₃, а далее реализуется в процессе  двумерного преобразования Фурье относительно времен t₁  и t₃  [1]. Очевидно, что форма и свойства генерирующегося импульса S зависят от падающих на образец импульсов A, B и C, их пространственного и временного распределения, и от оптических свойств среды.

Рис. 1. Порядок следования импульсов и изменение энергетического состояния в двухуровневой системе в результате их действия [1].

Большинство спектроскопических, в том числе нелинейных, методик третьего порядка не полностью измеряют функции отклика, обнуляя некоторые из переменных времени t₁, t₂ или t₃, интегрируя их и/или измеряя только модуль комплексной функции отклика. Двумерная ИК-спектроскопия, напротив, способна измерить функции отклика третьего порядка во всей их полноте, используя последовательность коротких импульсов, которые минимизируют свертки в уравнении для описания поляризации среды, что приводит к возможности регистрации как амплитудных, так фазовых компонент. Можно сказать, что двумерная ИК-спектроскопия извлекает максимальное количество информации об изучаемой молекулярной системе [2]. Например, в одномерном спектре невозможно различить связанные и несвязанные резонансы. Напротив, в двумерном спектре связанные резонансы приводят к формированию недиагональных перекрестных пиков с частотой поглощения одного резонанса и частотой излучения другого, тогда как несвязанные резонансы проявляются на двумерном спектре вдоль диагональной линии. На рисунке приведены одномерный и двумерный спектры двух линий паров калия. Линии соответствуют переходам из основного состояния в два различных возбужденных состояния и поэтому резонансы связаны между собой. В результате 2D-спектр показывает четыре пика. Два пика, обозначенные A и B, лежат на диагонали и  соответствуют переходам D1 и D2. Пики C и D представляют собой недиагональные перекрестные пики с частотой поглощения одного перехода и частотой излучения другого, как и ожидается для связанных резонансов.

Одномерный спектр поглощения (a), двумерный спектр (b) и соответствующие уровни энергии (c) паров калия [1].

Двумерная спектроскопия является технически сложной методикой, для её реализации необходимы точный контроль временных задержек между импульсами и определенное пространственное распределение пучков накачки для выполнения фазового синхронизма [3, 4]. Однако, все это помогает реализовать мощнейший инструмент для исследования молекулярной структуры и динамики сложных белковых комплексов на фемтосекундном масштабе времени с высоким спектральным разрешением. Дополнительная информация, а также гибкость во временном и поляризационном управлении лазерными импульсами, способствует идентификации и интерпретации спектральных линий, что особенно важно при изучении комплексов молекул. В последние годы разработано большое количество разнообразных улучшений метода многомерной инфракрасной спектроскопии. Так, полезным оказывается измерение двумерных спектров с одновременным нестационарным воздействием различной природы на исследуемый объект: скачок температуры, лазерная ионизация, быстрое смешивание, начало химической реакции и т.п. Многомерные эксперименты с использованием одновременно ИК и видимого излучения очень важны для изучения эффектов фотосинтеза.

Схема для двумерной ИК спектроскопии (лаб. 508 МГУ).

В лаборатории 508 МГУ имеется источник сверхкоротких импульсов среднего инфракрасного диапазона с микроджоулевыми уровнями энергий, что позволяет получить последовательность нескольких фемтосекундных импульсов, необходимых для реализации схемы двумерной инфракрасной спектроскопии. Этот источник включает в себя генератор фемтосекундных импульсов на кристалле Ti:Sapphire, регенеративный усилитель и две последовательные ступени понижения частоты (подробности см. в разделе Лаборатории и оборудование). Фемтосекундные импульсы среднего ИК диапазона далее используются в оптической схеме, представленной на рисунке. Для контроля временных задержек между импульсами используется две интерферометрические и квадратурное детектирование.

Для теоретического моделирования двумерной ИК спектроскопии будет использоваться квантовое описание процесса взаимодействия полей накачки с исследуемой средой с использованием формализма матрицы плотности и анализом ее  эволюции (и, соответственно, анализа динамического отклика вещества) на основе решения уравнения фон Неймана для матрицы плотности в приближении теории возмущений с учетом марковости релаксационных процессов. В настоящее время проведено тестирование численного кода на примере модельной системы — молекулы воды. При построении двумерных спектров восстанавливается ангармонизм колебаний в трехуровневой системе, что подтверждает корректность работы кода и возможность его применения для теоретического исследования отклика сложных молекулярных соединений и их динамики.

Пример рассчитанной двумерной спектрограммы молекулы воды для двух задержек зондирующего импульса.

Развиваемая методика нелинейной спектроскопия будет использована для структурной диагностики полупроводниковых наночастиц, сложных органических соединений и биомолекул. Методы двумерной ИК-спектроскопии помогут исследовать пространственно-энергетическое устройство молекул, охарактеризовать первичную и вторичную структуру белков в динамике, и позволят разобраться в процессах, отвечающих за конформационные изменения в белковых структурах, в частности, термо- и  фотоактивацию мембранных белков.

1. S. T. Cundiff and S. Mukamel, «Optical multidimensional coherent spectroscopy,» Phys. Today 66, 44–49 (2013).
2. P. Hamm and M. Zanni, Concepts and Methods of 2D Infrared Spectroscopy (Cambridge University Press, 2011).
3. X. Dai, A. D. Bristow, D. Karaiskaj, and S. T. Cundiff, «Two-dimensional Fourier-transform spectroscopy of potassium vapor,» Physical Review A 82, 052503 (2010).
4. T. Buckup and J. Léonard, Multidimensional Time-Resolved Spectroscopy (Springer, 2018).
5. D. R. Skoff, J. E. Laaser, S. S. Mukherjee, C. T. Middleton, and M. T. Zanni, «Simplified and economical 2D IR spectrometer design using a dual acousto-optic modulator,» Chemical physics 422, 8–15 (2013).