Опто- и термогенетика

Опто- и термогенетические методы при помощи света позволяют управлять конкретной популяцией нейронов с высокой точностью в пространстве и времени и являются незаменимыми инструментами, помогающими понять механизмы функционирования мозга и периферической нейронной системы. Развитие и более широкое применение методов опто- и термогенетической стимуляции при изучении живых животных требует детального изучения и точного контроля вызываемого ими теплового нагрева в мозге животного. Деликатность поставленной задачи накладывает множество ограничений на требуемый метод измерения температуры. Среди основных требований – максимальное отношение точности измерения к объему сенсора и возможность измерения температуры животного в формате эндоскопа.

Применение разработанных в последнее десятилетие оптогенетических технологий, основанных на использовании генетически кодируемых светочувствительных ионных каналов и флуоресцентных маркеров, позволяет с помощью оптических методов активировать нейроны требуемого типа или подавлять их активность, а также получать важную информацию о нейронной активности в данной области мозга посредством регистрации флуоресцентного сигнала. С помощью оптогенетических методов открываются возможности управления нейронной активностью свободноподвижных животных с высоким пространственным и временным разрешением. Для этого в нейроны выбранного типа генетически встраиваются специальные, играющие роль светочувствительных ионных каналов, белки, такие как каналродопсин или галородопсин, позволяющие соответственно активировать нейроны или подавить их активность. Активностью нервных клеток со встроенными каналами можно управлять оптическим излучением с определённой длиной волны.

В настоящее время спектр биофизических работ группы значительно расширился. Большое значение имеет сотрудничество с группой профессора В.В.Белоусова (Институт биоорганической химии РАН) в области термогенетики. Термогенетика новая перспективная область биологии, в частности, нейрофизиологии и нейростимуляции, суть которой заключается в принудительной и целенаправленной активации физиологической деятельности клеток, в частности нейронов, за счет использования термочувствительных катионных каналов (TRP).До недавнего времени широкое применение этой техники было ограничено из-за низкой чувствительности известных термоканалов и плохого пространственно-временного разрешения методики при нагреве среды и использовании химических агентов. Суть термогенетических исследований заключается в оптическом контроля и управления функциональной деятельностью, как отдельных клеток, так и целых живых организмов за счет изменения температуры специальных термочувствительных каналов, встраиваемых в мембраны клеток с помощью генной инженерии. Среди других текущих и перспективных задач в области биофотоники можно выделить развитие новых методов, в том числе с использований оптических волокон для исследования спектральных и временных свойств новых типов биомаркеров.
Термогенетика предлагает перспективный дополняющий подход, основанный на термочувствительных катионных каналах семейства TRP. Однако её широкое внедрение в исследование когнитивных функций мозга, пластичности нервной системы и различных биохимических процессов, протекающих в нервных клетках живого животного существенно ограничено отсутствием физических инструментов для локального измерения температуры и точного управления нагревом. В нашей работе мы продемонстрировали методику быстрой, надежной и воспроизводимой активации одиночных клеток в культуре и живом организме (invitroи invivo), экспрессирующихгенетически встроенныетермочувствительные каналы семейства TRPA1 с помощью инфракрасного лазерного излучения. В ходе работы были исследованы чувствительные к теплу мембранные каналы caTRPA1 техасской гремучей змеи Crotalus atrox, активирующиеся при превышении температуры2 8°С. Нейроны с этими каналами расположены у змеи в специальных ямках на носу, которые, как предполагается, выполняют роль глаз при охоте на теплокровных животных в ночное время суток. Исследования показали, что такие термочувствительные каналы могут быть успешно экспрессированы нейронами рыбы и теплокровных животных. Управление и мониторинг локальной температуры в экспериментах с термочувствительными клетками являются важнейшими задачами.

Развитие и более широкое применение методов опто- и термогенетической стимуляции при изучении живых животных требует детального изучения и точного контроля вызываемого ими теплового нагрева в мозге животного. Деликатность поставленной задачи накладывает множество ограничений на требуемый метод измерения температуры. Среди основных требований – максимальное отношение точности измерения к объему сенсора и возможность измерения температуры животного в формате эндоскопа. Мы использовали уникальное термометрическое устройство на основе гибридного оптического/СВЧ зонда с квантовым сенсором (микрочастица алмаза с дефектами азот-вакансия (NV-центрами) для адресного измерения температурыклеток с высоким пространственным разрешением. Локальный нагрев клеток был реализован при помощи инфракрасного лазерного излучение. Правильный подбор параметров излучения (длина волны и энергия) позволяет активировать термочувствительные клетки в культуре и в живой рыбке Daniorerio.Эксперименты по термогенетической активации проводились с живыми трансфецироваными клетками Human Embryonic Kidney (HEK-293),HeLa, нейронами и эмбрионами рыбок Daniorerio. Клеточные культуры подвергались генной модификации с помощью векторов, которыевстраиваясь в ДНК позволяют экспрессировать кальциевый индикатор GCaMP6s итермочувствительные каналы caTRPA1. Отклик биологической системы на лазерный нагрев полностью контролировался за счет оптической визуализации кальциевых токов и электрофизиологии. Был продемонстрирован поведенческий эксперимент на рыбке Daniorerio, в Rohon-Beard нейронах которой была осуществлена экспрессия термочувствительных каналов caTRPA1. Активация одного из группы этих нейронов, расположенных на спинке рыбы, приводит к реакции избегания, проявляющаяся в резком ударе хвоста. Проведение флуоресцентной микроскопии позволяло нам находить успешно трансфецированные нейроны, локальный нагрев которых осуществлялся импульсом инфракрасного излучения на длине волны 1342 нм длительностью 250 мс. Импульсный нагрев Rohon-Beard нейронов сопровождался ударом хвоста у трансфецированной рыбы. Таким образом мы продемонстрировали комплексную технику термогенетических исследованийадресованных к индивидуальным нейронам в культурах клеток и живых животных с использованием инфракрасного лазерного излучения.

Двухцветная конфокальная микроскопия трансфецированного нейрона мыши, показывающая распределение термочувствительных каналов caTRPA1 в мембране клетки (а) и наличие в теле клетки сенсора катионов кальция GCaMP6s (b). (с) Совмещенные изображения двух биомаркеров.

Схема поведенческого эксперимента с рыбкой Daniorerio, включающего локальный нагрев трансфецированных RohonBeard нейронов инфракрасным лазерным излучением и запись реакции рыбки быстрой камерой. (b) Термометрическое устройство на основе гибридного оптического/СВЧ зонда с квантовым сенсором — микрочастица алмаза с дефектами азот-вакансия.

Покадровая развертка реакции Daniorerioна на лазерный импульс длительностью 250 мс: (слева) локальный нагрев нейрона (лазерный пучок показан красной окружностью) и (справа) ответная реакция в виде удара хвостом.