Нелинейно-оптическая микроскопия и трехмерная визуализация биологических объектов

Нелинейно-оптическая биофотоника. Лазерная визуализация и стимуляция

Стремительное развитие фемтосекундных технологий к началу 2000-х годов привело к распространению новых методов лазерной микроскопии на основе нелинейно-оптических явлений: флуоресценция при поглощении двух или трех фотонов, генерация второй и третьей оптической гармоники, когерентное рамановское рассеяние и другие. Сверхкороткие импульсы ближнего ИК диапазона от 700 нм до 1300 нм проникают значительно глубже в биологическую ткань, чем используемое для конфокальной флуоресцентной микроскопии синее излучение. Квадратичная и кубическая зависимости полезного сигнала от интенсивности накачки позволяет эффективно подавить генерацию фотонов вне фокуса и получить контрастное изображение из глубины. Проведение одновременно нескольких методик визуализации, предоставляющих дополнительную информацию об объекте, позволяет говорить о мультимодальной микроскопии.

Наши исследования направлены на выявление новых сценариев генерации нелинейных сигналов в биотканях, повышение качества многофотонной микроскопии, определение фундаментальных пределов визуализации и преодоление их. Мы сотрудничаем с биологическими лабораториями для совместного решения задач молекулярной биологии, нейрофизиологии, медицины и лазерной физики. Помимо этого, наша работа тесно связана с прикладными проблемами разработки новых лазерных систем для мультимодальной многофотонной микроскопии и нелинейно-оптической биопсии реального времени для внутриоперационной диагностики.

Оптогенетические инструменты для мультимодальной многофотонной микроскопии

Флуоресцентная нелинейно-оптическая микроскопия вместе с современными методами маркирования предоставляет уникальный инструмент для визуализации на молекулярном уровне как нормального гомеостаза клеток живых животных, так и патологических процессов, с субмикронным пространственным разрешением. Использование генетических конструкций позволяет настроить экспрессию белков-индикаторов сигнальных молекул и ионов в различных типах клеток организма и их органеллах. Считывание состояния флуоресцентных сенсоров в рассеивающей ткани требует создания новых методов многофотонной микроскопии и оптимальных лазерных источников.

В нашей лаборатории разработана оптическая система, объединяющая четыре источника фемтосекундных импульсов, синхронизованные с лазерным сканирующим микроскопом, для многомодальной количественной микроскопии сенсоров в живых животных. На рисунке показана концепция двухфотонного опроса парой фемтосекундных импульсов на 790 нм и 980 нм сенсорного белка пероксида водорода (H2O2) HyPer7. Изменение отношения яркости флуоресценции в зеленом диапазоне этого ратиометрического сенсора при последовательном возбуждении на 790 нм и 980 нм несет информацию о количестве перекиси, важной сигнальной молекуле. Также была реализована лазерная система для измерения двухфотонных спектров эффективности φσ2 возбуждения флуоресценции, на которой исследованы сенсоры HyPer7 и SyHer3s (сенсор кислотности).

Визуализация патологических процессов в живых животных

Визуализация динамики пероксида водорода H2O2 в нейронах мыши при развитии ишемического инсульта является важной задачей для разработки новых лекарств. Для решения этой задачи в мозг мыши производилась инъекция вирусных частиц, несущих генетические конструкции с HyPer7 для экспрессии белков-сенсоров в нейронах. На место отверстия в черепе устанавливалось краниальное окно диаметром 5 мм (d), через которое осуществляется микроскопия, а также инспекция уровеня экспрессии белка в ткани (e). Между стеклом окна и поверхностью коры мозга обычно располагается слой твердой мозговой оболочки (dura mater) толщиной ~100 мкм, насыщенный кровеносными сосудами и коллагеном, что отлично визуализируется при помощи генерации третьей (f) и второй (g) оптических гармоник импульсами на длине волны 1250 нм. Высокая энергия импульсов позволяет трехфотонно возбуждать флуоресценцнию HyPer7 (3PEF) в нейронах коры за мозговой оболочкой (h). Полученные таким образом изображения заметно контрастнее, чем предоставляемые двухфотонной микроскопией (i, j), но техника весьма требовательна к мощности источника. Значимый двухфотонный ратиометрический опрос HyPer7-нейронов удалось добиться парой импульсов на длинах волн 790 нм и 980 нм на глубинах до 600 мкм от поверхности мозга (k). Таким образом, в нашей лаборатории развиваются лазерные технологии для количественного исследования эффективности возбуждения различных флуоресцентных сенсоров и визуализации их в клеточных культурах, переживающих срезах, живых рыбах и различных органах анестезированных мышей.

Молекулярные основы безмаркерной микроскопии

Природа генерации второй и третьей оптических гармоник (ГВГ и ГТГ) в биоткани различается. Квадратичная нелинейная восприимчивость, необходимая для удвоения оптической частоты, возникает только в средах не обладающих центром инверсии, что подразумевает упорядоченного расположения длинных молекул, проявляющих высокую квадратичную гиперполяризуемость. С другой стороны, третья гармоника чувствительна к гетерогенности оптических свойств ткани нежели ее молекулярному составу и степени упорядоченности, что позволяет с ее помощью рассмотреть полости, границы, включения и другую морфологию оптически почти однородной неокрашенной биоткани. Рассмотрим примеры.

Генерация второй гармоники весьма требовательная к условиям, поэтому в человеческих клетках линии HeLa возникает только при активной фазе деления — митозе. К окончанию профазы клетка копирует ДНК, создавая двойной набор хромосом. Следующий этап деления, прометафаза, уже может быть отлично визуализирован при помощи ГВГ и ГТГ микроскопии. Третья гармоника проявляет возникающую шарообразную форму клетки из-за нарушения цитоскелета, хорошо видны отдельные органеллы в цитоплазме, пропадает ядерная мембрана.

Вторая гармоника показывает веретено деления, состоящее из плотно уложенных, единым образом поляризованных микротрубочек, формирующих высокую макроскопическую квадратичную восприимчивость. Все последующие фазы митоза также хорошо различимы на изображениях, получаемых безмаркерной микроскопией. В течение метафазы хромосомы прикрепляются кинетохорами к микротрубочкам для их транспортировки к центросомам на этапе анафазы. Заметно, что при этом клетка изменяет свою форму на овальную. В заключительной фазе деления, телофазе, разделение хромосом завершается разрывом мембраны материнской клетки для формирования двух независимых мембран дочерних клеток. Слева показана клетка HeLa на этапе метафазы, в которой одновременно визуализируется морфология при помощи ГТГ (THG), кислотность в митохондриях сенсором SypHer3s (mitoch), хромосомы (3PEF-H2B) и веретено деления второй гармоникой.

Некоторые наши статьи по теме

Ermakova Y.G. et al. Thermogenetic neurostimulation with single-cell resolution // Nature Comm. 2017. Vol. 8. P. 15362.
Доронина-Амитонова Л.В. et al. Нейрофотоника: оптические методы исследования и управления мозгом // Успехи физических наук. 2015. Vol. 185, № 4. P. 371–392.
Lanin A.A. et al. Two- and three-photon absorption cross-section characterization for high-brightness, cell-specific multiphoton fluorescence brain imaging // J. Biophotonics. 2020. Vol. 13, № 3. P. e201900243.
Lanin A.A. et al. Cell-specific three-photon-fluorescence brain imaging: neurons, astrocytes, and gliovascular interfaces // Opt. Lett., 2020. Vol. 45, № 4. P. 836–839.
Chebotarev A.S. et al. Enhanced-contrast two-photon optogenetic pH sensing and pH-resolved brain imaging // J. Biophotonics. 2021. Vol. 14, № 3. P. e202000301.
Pochechuev M.S. et al. Multimodal nonlinear-optical imaging of nucleoli // Opt. Lett, 2021. Vol. 46, № 15. P. 3608–3611.
Lanin A.A. et al. Single-beam multimodal nonlinear-optical imaging of structurally complex events in cell-cycle dynamics // Journal of Physics: Photonics. IOP Publishing, 2021. Vol. 3, № 4. P. 044001.
Doronina-Amitonova L.V. et al. Nonlinear-optical brain anatomy by harmonic-generation and coherent Raman microscopy on a compact femtosecond laser platform // Applied Physics Letters. 2011. Vol. 99, № 23. P. 231109.
Chebotarev A.S. et al. Multimodal label-free imaging of murine hepatocellular carcinoma with a subcellular resolution // Journal of Biophotonics. 2023. e202300228.